1、Winston Kuo哈佛大学目前有两种通用策略1 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达2 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染方法的选择取决于实验的设计一般说来，我们倾向于外源试剂的转染载体病毒的策略还依赖DroshaDicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。

2、引物设计好以后，在NCBI上做一个primerblast，检测一下是否有非特异性扩增最好还是通过实验验证，如果是定量PCR引物 a 溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的。

3、第二步连接反应后，逆转录引物杂交到3端接头，开始启动RTPCR 扩增一般是12个循环由于小且片段大小可预测120bp 接头序列加上2030bp miRNA插入片段，文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收 由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接tRNA和snoRNA，切胶回收非常重要这种文库制备方法导致文库的测序。

4、反转录是不会冲突的，后期表征所需的QPCR引物下游引物是根据反转录的茎环引物设计的，而上游引物特异性要求则很高，是特异性针对某一miRNA的序列来设计的。

5、不能通用这个和普通的反转录pcr一样，反转录成cDNA第一链，单链再做pcr扩增，逆向引物当然是和反转录引物部分相同，而不是互补U6是一类核小分子RNA，由RNA聚合酶III启动做miRNA的qRTPCR有茎环法和加尾法，U6很常用。

6、miRNA是小RNA啊总RNA反转包括了所有mRNA以及一部分rRNA前者是做RNA干扰研究的，后者是常规实验了。

7、a 溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附件 b 琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时PCR产物在100bp一下。